DNA聚合連鎖反應與諾貝爾化學獎──莫理 |
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【摘要】核化連鎖反應的威力早在1940年代日本廣島上空便向世人展現,並在反應爐中成為帶動科學的原動力。如今生物界的DNA聚合連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)則在40年後重新登場,在試管中幫助世人了解生命的奧祕。
今年的諾貝爾化學獎頒給兩位北美的分子生物學家:凱利‧莫理斯(Kary B. Mullis)及麥克‧史密斯(Michael Smith)。其中莫理斯的主要貢獻在於,發明了在試管中以連鎖反應方式複製基因片段的技術;他將之命名為「DNA聚合連鎖反應」。是項技術發展至今,其應用之多樣性也有如連鎖反應般的令人無法完全跟進。而PCR對於基礎及臨床醫學的貢獻之深遠,也難以估計。難怪莫理斯在得獎時,一點也不驚訝地表示:「我自恃他們總有一天會頒獎給我的。」
諾貝爾獎委員會在莫理斯的得獎說明中提及「PCR的應用甚至給了科幻小說家靈感,攝製了一部極為賣座的電影:『侏儸紀公園』」。此片描述科學家擅用PCR將蚊子化石中所殘留的恐龍血,複製成恐龍…。
試管複製DNA陷入兩難
PCR其實源於一個很簡單的想法,那就是如何利用DNA聚合複製DNA的速率及精確度,在試管中生產大量特定DNA片段。其數學基本原理實際很單純,即由一變二,二變四,以2n次方增加。
體內控制DNA複製的條件相當複雜,所需的反應分子極多。DNA每經複製一次後即由單股DNA歸回雙股DNA,此時相對應之鹼基便以A=T,G≡'C氫鍵結合無法分開而繼續複製。若要將雙股DNA再變回單股,則需細胞核內解股及單股DNA維持蛋白來達成。在體外試管中,因無需顧慮高溫會使細胞致死,故可直接用高溫(90℃以上)來使雙股之模版DNA變為單股,但此時卻需顧慮所用之DNA聚合會因高溫變性而失效,無法重複利用。因為這個原因,試管複製DNA陷入兩難:不加熱,模版DNA無法變成單股,若加熱了,DNA聚合又會變性。
因此,1985年莫理斯最先報告的PCR論文中所提供的方法是:於每一次複製將模板DNA加熱分開成單股後就加一次DNA聚合,當時用的是由E. coli細菌中萃取純化之DNA聚合(1)。但是若想將複製次數增加到20~30次時,上述方法變得繁瑣不堪,且因試管中變性之DNA聚合亦逐次增多,會妨礙DNA產品之產量。
發現了耐高溫的DNA聚合
好在,中國人的發現改變了兩難困境:現任教於陽明醫學院神經科學研究所的錢嘉韻教授,早在1976年留美時即已報告了一項新發現:某種由美國黃石公園溫泉所分離出的細胞( Thermus aquaticus, YT-1),其DNA聚合具有耐高溫之特性。該篇論文詳述了此DNA聚合之純化步驟,及此酵素之相關特性。例如,複製DNA之最適溫度(高達80℃)、最適pH值、二價鎂離子(Mg++)之必要性,以及此酵素有別於嗜溫菌E.coli之DNA聚合,並不具有外切核酸分解(3'→5' exonuclease)之效等等(2)。
此篇論文後來被莫理斯所在Cetus公司工作之PCR發展小組所爰用。以Thermus aquaticus之DNA聚合(Taq DNA polymerase),取代了先前所用之E. coli DNA聚合。這項改變使得PCR反應成為可以自動化的一項技術,只需在第一個複製循環(cycle)加過一次Taq DNA聚合,即可連續複製30個循環以上,所得DNA片段的特異性比用E.coli的酵素要好得多。整個反應可使微量的DNA模板在2~3小時小內,在一根試管中複製百萬倍以上(見圖一)。如此一來,PCR變得既省力(不需專人每二分鐘加一次酵素,要加30次)、省時又省錢(酵素的用量為先前的1/30)。Cetus公司的研究小組於1988年重新整合PCR過程,發表了改用TaqDNA聚合後之PCR作法及其應用之潛力(3)。
整個過程簡單地來說只需在三種不同溫度下進行20~30個循環即可完成(見圖二)。
一、首先將模版DNA以94℃加熱30秒~1分鐘,使之由雙股分開成為單股。
二、將由人工合成之「引子對」(primer pairs)加入反應試管中降溫到50℃左右,使之與單股模版DNA進行黏合(annealing),此步驟亦僅費時30秒至1分鐘。引子對是為決定複製片段大小之關鍵所在。能在50℃與模版DNA完全吻合之引子對,必能將標定之基因片段正確地複製出來,降低因非特異性黏合所造成之複製膺品。這正是E. coli DNA聚合在37℃所不能辦到的。
三、再升溫到72℃,以利Taq DNA聚合在其最適溫範圍,複製上述有引子黏合之單股DNA模版,需時亦在1分鐘之內。所以完成上述一個循環只需2~3分鐘,在一個溫度循環機(thermalcycler)內完成30次循環僅需時約2小時左右,即可將特定基因片段複製230倍。較之於一般的基因選殖方式既省時又省力得多。
自從1988年上述PCR流程發表後,應用此技術的論文亦急速上升,涵蓋範圍包括有遺傳疾病之診斷、病毒感染之診斷、產前篩檢嬰兒性別、法醫鑑定罪犯、考古學家鑑定古人之身分及古生物種系之相關性、基礎醫學的研究更是林林總總,數不勝數(4)。
不與任何主流研究機構牽連
至於今年才48歲的莫理斯,許多人認為他與歷來諾貝爾獎得主實不相同,他並非自學術地位崇高的哈佛、史坦福、麻省理工學院等內孕育出來得獎之成果。他現已離開Cetus公司,轉而自行在加州拉尤拉市的家中從事顧問性的工作,悠然自得,並不與任何主流的研究機構有關連。曾有一位不願具名的前諾貝爾獎得主甚至批評他的發明雖然對世界影響極大,但也只不過是一項純技術性的巧思而已,缺乏學術性內涵,不夠諾貝爾獎的水準…。針對此點,一位支持者卻反駁說:「真是如此嗎?為什麼我就沒想到呢?」
莫理斯回憶當初是在1983年,有一天晚上開車經過加州紅木森林區時,獲得了PCR的靈感。當他與同事分享之時,大部分的人均對可行性抱持懷疑的態度,但是由於他的堅持,他成功了。這的確要歸功於他想到要利用耐高溫之Taq DNA聚合,才臻全功。Cetus公司認同他的想法,決定發展PCR之初曾因此獎勵他美金一萬元,其後卻於1991年轉手將專利權以美金3億元賣給了瑞士的哈福門-拉羅奇大藥廠(Hoffman-la Roche)。該公司現正以連鎖反應般的速率賺進美金。由於該公司壟斷PCR及Taq DNA聚合銷售市場的行動,引發了科學研究人員之公開討論及反感。不論如何,莫理斯本身的成就卻沒有沾染太多的銅臭味,「讓學術歸學術,盈利歸盈利」。他對整個科學界的貢獻,絕非以金錢可來評斷。
最後,令人欣慰的是今年的生理醫學獎得獎的工作,台灣留美的周芷教授肯定有極其直接之參與及貢獻,而化學獎得獎的PCR工作,錢嘉韻教授也有極重要的間接貢獻。雖然二人均未獲獎,但仍然值得肯定及鼓勵。若國家能掌握正確的科學教育大方向,則終有一朝,本國的優秀青年科學家必能在諾貝爾獎的各領域中帶回完全屬於中國人的榮耀。
參考資料
1. Mullis, K., al., 1985, Science, Dec. 20, 1350.
2. Chien, A., et al., 1976, J. Bact., 127:1550.
3. Saiki, et al., 1988, Science, 239:487.
4. PCR:A Practical Approach, IRL Press, 1991.
張南驥任教於陽明醫學院微免所 本文摘自天下圖書 諾貝爾的榮耀-化學桂冠Nobel Laureates
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